Nitrospira – нитрит-окисляващите бактерии в аквариумите

Автор: Серга Татяна

Докато опознава теоретичните основи на хобито си, всеки акварист рано или късно прочита за азотния цикъл. Покрай това научава и за описваната вече повече от 30 години по този начин нитрификация в аквариумите – бактериите от рода Nitrosomonas (Nitrosomonas europaea) окисляват амоняка до нитрити, а бактериите от рода Nitrobacter (Nitrobacter winogradskyi) окисляват нитритите до нитрати.

Освен всичко друго, тази представа за аквариумната нитрификация е служила и служи като основа за производството на промишлени бактериални добавки от Nitrosomonas и Nitrobacter, предназначени за ускоряване на формирането на азотен цикъл в аквариумите.

Бактериите от родовете Nitrosomonas и Nitrobacter наистина са нитрифициращи. Въпреки това научни доказателства за решаващата им роля точно в нитрификацията в аквариум никога не е имало. Как тогава се е родила тази догма на акваристиката?

Изследванията на нитрифициращите бактерии са се провеждали най-вече за целите на пречистването на отпадни води, в които за доминиращи нитрификатори се смятали представителите на родовете Nitrosomonas и Nitrobacter. Предполагало се е, че те би трябвало да доминират и в други водни среди, съдържащи предпочитаният от тези бактерии субстрат, тоест в аквариумите. На всичко отгоре нямало строги научни доказателства за това, че Nitrosomonas и Nitrobacter доминират в отпадните води. Проби от тези води се култивирали в лаборатории в обогатени среди, а след това се оценявало какви бактерии преобладават като количество във вече подхранената култура. Точността на методите за идентификация не била на ниво. Освен това станало ясно, че култивирането в лабораторни условия оказва селективно влияние на различните видове бактерии и по-конкретно върху Nitrosomonas europaea. С други думи клетките на Nitrosomonas europaea преобладават числено в лабораторните съдове, въпреки че други видове доминират в средата, от която е взета пробата.

Изследванията на нитрификацията в аквариумна среда започнали доста по-късно. Най-много са изучавани измененията на концентрацията на амоняк, нитрити и нитрати в зависимост от различни параметри, но без определяне и количествена оценка на видовия състав на бактериалните колонии.

Така твърдението за доминиращата роля на Nitrosomonas и Nitrobacter в аквариумите станало теоретично предположение, направено на базата на неточни и изкривени резултати от изследвания на отпадни води.

По-късно завесата, спусната пред тайната на аквариумната нитрификация, била вдигната благодарение на използването на съвременните методи на молекулярната биология, които позволяват с голяма точност да се определи и да се оцени количествено видовият състав на бактериалните колонии. Своята роля изиграло и случайното стечение на обстоятелствата.

През 1990 г. Биологът Тимъти Хованек създал лаборатория за изучаване на различните аспекти на аквариумната химия и биология, в това число и ефективността на различните системи за биофилтрация. Заради това било необходимо детайлно проучване на бактериалните общества в аквариумите. Дотогава научната работа на Хованек била свързана предимно с изследвания върху рибите, затова мислел, че преброяването на изучаваните обекти не би трябвало да е проблем.

По собствените му думи, казани в едно интервю, докато преглеждал научната литература, за да състави план за собствените си изследвания, бил потресен от факта, че при проучванията на аквариумните нитрификатори никога не били прилагани методи за количествена оценка на бактериите. Затова Хованек решил да разработи такава методика. Той не се опитвал да изясни кой точно осъществява нитрификацията в аквариума, а планирал да оцени при различни условия количеството от онези бактерии, които вече 30 години били наричани в литературата нитрификатори - Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi.

По време на една конференция Хованек се запознал с успехите в изучаването на произхода и родствените връзки между цихлидите, достигнат благодарение на ДНК анализ на рибите. По-късно разбрал, че един от водещите в изучаването на бактериите с подобни методи специалисти, професор Едуард ДеЛонг, оглавявал една от лабораториите в Калифорнийския университет. В лабораторията на ДеЛонг Хованек усвоил съвременните молекулярни методи за изследване на бактериите. След това, вече в своята лаборатория, разработил методика, з помощта на която искал да оцени количествените изменения на Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi в аквариумите филтри.

Веднага го застигнал “неуспех”. Съвременните изключително точни методи по някаква причина не откривали Nitrobacter winogradskyi в нито един аквариум. Nitrosomonas europaea не били открити в сладководните аквариуми, а в морските ги имало, но не преобладавали. Същевременно измененията на концентрацията на амоняк, нитрити и нитрати показвали, че в аквариумите протича нитрификация. Хованек повтарял експериментите многократно в продължение на цяла година. Резултатите не се променили. Така задачата за количествена оценка на Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi била снета от дневния ред. Било очевидно, че преди да се оценява количеството нитрифициращи бактерии, трябва да се изясни кои точно бактерии осъществяват нитрификацията в аквариума.

Отначало Хованек решил да съсредоточи вниманието си върху нитрит-окисляващите бактерии. С помощта на методите на молекулярната биология той установил, че окислението на нитритите в сладководни и морски аквариуми се осъществява от бактерии от рода Nitrospira. Дотогава се смятало, че тези бактерии не играят съществена роля в нитрификацията във водна среда.
Хованек повторил изследванията си нееднократно с проби от филтрите и грунда на сладководни и морски аквариуми с различно количество риба и с моделиране на динамиката на амонячно съдържание чрез добавяне на амониев хлорид. Във всеки един от случаите количествено доминиращи били нитрит-окисляващите бактерии Nitrospira. Бактерии Nitrobacter не били открити в нито една от пробите. Хованек установил, че появата на бактериите Nitrospira в количества, подлежащи на определяне, ставало от 12-тия до 22-рия ден след стартирането на аквариума. Появата и промяната на броя им съответствали на динамиката на окисление на нитритите до нитрати.

Освен това Хованек изследвал влиянието на промишлените бактериални препарати, съдържащи Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi, предназначени за ускоряване на формирането на азотен цикъл. Бактериалните добавки не ускорявали старта на нитрификацията и не променяли състава на бактериалното общество в сравнение с контролните аквариуми. В същото време концентрацията на нитрити и амоняк все така достигали токсични нива, преди да започнат да спадат. Въпреки добавянето на препарати, съдържащи Nitrobacter winogradskyi, тези бактерии не успявали да се заселят нито в сладководни, нито в морски аквариуми в значими количества. При добавянето на препарати, съдържащи Nitrosomonas europaea, бактериалната картина също не се изменяла.
Единственият полезен ефект от добавянето на тези препарати било по-бързото увеличаване на количеството бактерии Nitrospira. Поради недостатъчно данни било невъзможно да се прецени доколко този ефект бил съществен. Хованек предположил, че той се дължи на влиянието на хранителните вещества в добавките.

Горе-долу по същото време три други изследователски групи (една в Австралия и две в Германия) публикували резултати от проучвания, доказващи, че бактерии, подобни на Nitrospira, а не бактериите от рода Nitrobacter, причиняват нитрификацията в много различни типове аквариумни системи.

Така откритията на Хованек за ролята на нитрит-окисляващите бактерии Nitrospira в аквариумите били потвърдени.

Изследванията продължили около пет години. През това време в научната литература се появили трудове на други изследователи, които доказвали, че подобни на Nitrospira бактерии са всъщност доминиращите нитрит-окислители и в пречиствателните станции за отпадни води. Тези изследвания показали също, че изводите за доминиращата роля на Nitrosomonas europaea при окислението на амоняка са погрешни. С използването на методите на молекулярната биология се изяснило, че в пречиствателните станции за отпадни води преобладават три основни групи амоняк-окисляващи бактерии – бактерии, родствени на Nitrosomonas europaea; Nitrosococcus mobilis и родствени на тях, както и трета група от неизвестни бактерии, които никой не успял да идентифицира и култивира. Числено преобладаващи се оказали бактериите Nitrosococcus mobilis.

Хованек и досега продължава изследванията си. Следващата му задача е изучаването на амоняк-окисляващите бактерии. Получените до момента резултати са следните. В бактериалните общества във филтрите на сладководните аквариуми преобладават амоняк-окисляващи бактерии, близкородствени на Nitrosomonas marina. В морските аквариуми пък родът Nitrosomonas съставлява около 20% от бактериалното общество.

Във връзка с откриването на ключовата роля на бактериите Nitrospira в окислението на нитритите, във Виенския университет е създаден международен проект за изучаването на тези бактерии. Една от основните цели, стоящи пред изследователите, е изолирането на генома на тези бактерии, изучаването на нитрит-окисляващите им механизми и на взаимодействието им с другите бактерии.

За акваристите е важно да знаят кои точно бактерии в аквариумите са нитрити окисляващи и амоняк-окисляващи. Това е нужно, за да можем грамотно да решим въпроса за целесъобразността на употребата на бактериални препарати, а също и да изберем подходящи такива. Като знаем кои бактерии осъществяват тези процеси, като познаваме биохимията и физиологията на тези бактерии, ще можем да поддържаме условия, благоприятстващи максимално ефективната биофилтрация, както и да отстраняваме възникналите проблеми. Един от тях например е продължителният период на токсична концентрация на нитрити. Като изучаване особеностите на нитирит-окисляващите бактерии, ще можем да разберем какви условия ще инхибират техния ръст и как да разрешим този проблем.

За съжаление достоверните научни данни за бактериалните общества в аквариумите в момента са крайно недостатъчни. Огромната част от написаното в популярната литература за акваристика са теоретични предположения или се основава на стари изследвания, проведени още преди навлизането на употребата на точните методи на молекулярната биология. Твърде вероятно е много от твърденията в тях скоро да бъдат преразгледани.


Методи, използвани от Хованек в изследванията му.
Изолиране на бактериална ДНК от аквариумни проби. Определяне и количествена оценка на видове и състав на бактериалните общества на базата на анализ на изолираната ДНК (изолиране и клониране на ДНК; използване на молекулярни сонди, специфични за определени видове бактерии; електрофореза в градиента на денатуриращия агент DGGE, амплификация на фрагментите от получения генетичен материал чрез използването на полимеразна верижна реакция PCR и др.). Повече подробности за методите на Хованек могат да се научат от публикациите му, цитирани в списъка с използвана литература.

Тимъти Хованек (Dr. Timothy A. Hovanec, Ph.D)
Научен ръководител на «Aquaria Inc.». Консултант по частни и правителствени договори, свързани с аквакултури в няколко държави. Автор на няколко патента. По образование е биолог (Държавния университет в Сан Диего, където е получил научни степени бакалавър и магистър), има научна степен Ph. D. (доктор), която е защитил през 1998 г. в Калифорнийския университет.

Бактериите от рода Nitrospira
Грам-отрицателни, хемолитоавтотрофни аеробни нитрит-окисляващи бактерии. Срещат се в сладки и солени води, наноси, почви, системи за нагряване на вода, пречиствателни системи за отпадни води, системи за аквакултури и аквариуми.

Като източник на въглерод използват неорганичен въглерод (HCO3- и CO2), като са способни да използват и пируват в аеробни условия. По данни от някои изследвания определена концентрация на достъпен органичен въглерод в средата може да им повлияе благоприятно. Ръстът на тези бактерии се инхибира при концентрация на органични вещества 0,75 г/л или повече. Времето за удвояване на популацията е между 12 и 32 часа. Оптималните условия в минерална среда са температура 39ºC, pH 7,6-8,9, концентрация на нитрити 0,35 mM. В момента в научната литература Nitrospira се смятат за доминиращите нитрит-окисляващи бактерии във водни среди. Идентифицирани и описани са два вида - Nitrospira marina и Nitrospira moscoviensis.

Голямото разнообразие и широкото разпространение в естествени и изкуствени среди свидетелстват за това, че тези нитрит-окисляващи бактерии са доста конкурентоспособни, адаптират се добре и играят ключова роля в азотния цикъл в много екосистеми.





Списък с използвана литература.

Публикации на Т. Хованек за изследванията на нитрифициращи бактерии.

 В професионални научни издания.
1. Hovanec T. A. 1995. «New Trends in Biological Filtration.» In Annual Conference Proceedings of the 1995 AZA/CAZPA Conference. pp. 217-223. Seattle Washington, September 15-19, 1995.
2. Hovanec T. A. and E. F. DeLong. 1996. «Comparative Analysis of Nitrifying Bacteria Associated with Freshwater and Marine Aquaria». Applied and Environmental Microbiology 62(2888-2896).
3. Hovanec T. A.,  L. T. Taylor, A. Blakis and E. F. DeLong. 1998. «Nitrospira-like bacteria associated with nitrite oxidation in freshwater aquaria». Applied and Environmental Microbiology 64(1): 258-264.
4. Hovanec T. A.,  Burrell, P.C. and  C. M. Phalen. 2001. «Identification of Bacteria Responsible for Ammonia Oxida-tion in Freshwater Aquaria». Applied and Environmental Microbiology 67(12): 5791-5800.

 В издания, посветени на акваристиката.
«Nitrifying Bacteria-Part 1: Without them there is no aquarium hobby.»,  «Nitrifying Bacteria-Part 2: The mystery of the missing bacteria.»,  «Radical approach to aquarium starter kits.»,  «Nitrospira not Nitrobacter.»  (в «Aquarium Fish Magazine»). «Nitrospira: the real nitrite-oxidizing bacteria in aquaria.»,  «Nitrospira, not Nitrobacter... Again!»,  «What are the ammonia-oxidizing bacteria really?»  (в «Aquarium Frontiers»).  «Who are the bacteria really responsi-ble for nitrification.» (в  «Pet Dealer»).

Публикации на други автори в професионални научни издания.
1.Altmann, Dorte, P. Stief, R. Amann, D. de Beer and A. Schramm. 2003. «In situ distribution and activity of nitrifying bacteria in freshwater sediment.» Environmental Microbiology, vol. 5, no. 9. Society for Applied Microbiology. (798-803).
2. Burrell P. C., Keller J. and Blackall L. L. 1998. «Microbiology of a nitrite-oxidizing bioreactor.» Appl. Environ. Microbiol. 64: 1878-1883.
3. Burrell P. C., Keller J.  and Blackall L. L.. 1999. «Characterisation of the bacterial consortium involved in nitrite oxidation in activated sludge.»  Water Science and Technology, Volume 39, Issue 6, March 1999, Pages 45-52.
4. Daims H., Nielsen J. L., Nielsen P. H., Schleifer K.-H.  and Wagner M.. 2001. «In Situ Characterization of Nitro-spira-Like Nitrite-Oxidizing Bacteria Active in Wastewater Treatment Plants.» Applied and Environmental Microbiol-ogy, November 2001, p. 5273-5284, Vol. 67, No. 11
5. Daims H., Purkhold U., Bjerrum L., Arnold E., Wilderer P. A. and Wagner M. 2001. «Nitrification in sequencing biofilm batch reactors: lessons from molecular approaches.» Wat. Sci. Tech. 43: 9-18.
6. Daims H., Ramsing N. B., Schleifer K.-H. and Wagner M. 2001. «Cultivation-independent, semiautomatic determi-nation of absolute bacterial cell numbers in environmental samples by fluorescence in situ hybridization.» Appl. Envi-ron. Microbiol. 67: 5810-5818.
7. Daims H., Nielsen P., Nielsen J.L., Juretschko S., Wagner M. 2000. «Novel Nitrospira-like bacteria as dominant nitrite-oxidizers in biofilms from wastewater treatment plants: Diversity and in situ physiology.» Wat. Science Tech-nol. 41: 85-90.
8. Ehrich S., Behrens D., Lebedeva E., Ludwig W. and Bock E. 1995. «A new obligately chemolithoautotrophic, ni-trite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship.» Arch. Microbiol. 164: 16-23.
9. Grommen R., Dauw L.  and Verstraete W.. 2005. «Elevated salinity selects for a less diverse ammonia-oxidizing population in aquarium biofilters.» FEMS Microbiology Ecology, Volume 52, Issue 1, 1 March 2005, Pages 1-11.
10. Juretschko S., Timmermann G., Schmid M., Schleifer K.-H., Pommering-Röser A., Koops H.-P. and Wagner M. 1998. «Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitroso-coccus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations.» Applied and Environmental Microbiology. Vol. 64:3042-3051.
11. Juretschko S., Loy A., Lehner A.  and Wagner M.. 2002. «The Microbial Community Composition of a Nitrifying-Denitrifying Activated Sludge from an Industrial Sewage Treatment Plant Analyzed by the Full-Cycle rRNA Ap-proach.»  Systematic and Applied Microbiology, Volume 25, Issue 1, 2002, Pages 84-99.
12. Kelly J. J., Siripong S., McCormack J., Janus L. R., Urakawa H., Fantroussi S. El, Noble P. A., Sappelsa L., Ritt-mann B. E. and Stahl D. A.. 2005. «DNA microarray detection of nitrifying bacterial 16S rRNA in wastewater treat-ment plant samples.»  Water Research, In Press, July 2005.
13. Schramm A., de Beer D., Wagner M.  and Amann R.. 1998. «Identification and Activities In Situ of Nitrosospira and Nitrospira spp. as Dominant Populations in a Nitrifying Fluidized Bed Reactor.» Applied and Environmental Mi-crobiology, September 1998, p. 3480-3485, Vol. 64, No. 9
14. Sugita H., Nakamura H.  and Shimada T.. 2005. «Microbial communities associated with filter materials in recircu-lating aquaculture systems of freshwater fish.»  Aquaculture, Volume 243, Issues 1-4, 3 January 2005, Pages 403-409.
15. Tal Y., Watts J. E. M., Schreier S. B., Sowers K. R.  and Schreier H. J.. 2003. «Characterization of the microbial community and nitrogen transformation processes associated with moving bed bioreactors in a closed recirculated mariculture system.»  Aquaculture, Volume 215, Issues 1-4, 10 January 2003, Pages 187-202.
16. Third K.A., Sliekers A. O., Kuenen J.G.  and Jetten M.S.M..2001.  «The CANON System (Completely Autotrophic Nitrogen-removal Over Nitrite) under Ammonium Limitation: Interaction and Competition between Three Groups of Bacteria.»  Systematic and Applied Microbiology, Volume 24, Issue 4, 2001, Pages 588-596.
17. Toonen R. J.  and Wee C. B.. 2005. «An experimental comparison of sediment-based biological filtration designs for recirculating aquarium systems.»  Aquaculture, In Press, June 2005

превод: Боян Калинов